La observación microscópica óptica puede hacerse rápidamente, pero su precisión depende de la experiencia del analista y la calidad del equipo utilizado. A menudo, la legislación limita el uso del microscopio por parte del médico para fines diagnósticos fuera de un laboratorio certificado.
Puede ser necesario el examen microscópico del tejido para distinguir la enfermedad invasiva de la colonización superficial, una distinción que no se logra fácilmente mediante métodos de cultivo.
La mayoría de las muestras se tratan con tinciones que colorean a los microorganismos, destacándolos así del fondo, aunque pueden usarse preparados húmedo sin tinción para detectar hongos y algunos otros patógenos.
El médico debe pedir una tinción de acuerdo con el patógeno que sospecha. Sin embargo, ninguna tinción es 100% específica (es decir, diferentes organismos pueden teñir de manera similar). La mayoría de las muestras se tratan con una tinción de Gram, y si se sospecha la presencia de micobacterias, con una acidorresistente (tinción de Ziehl-Neelsen). Sin embargo, algunos patógenos no se observan fácilmente con estas técnicas; si se sospecha su presencia, se requieren otras tinciones u otros métodos de identificación.
Como la detección microscópica en general requiere una concentración de microorganismos de al menos aproximadamente 1 × 104-5/mL, la mayoría de las muestras de líquidos (como líquido cefalorraquídeo) deben concentrarse (p. ej., por centrifugación) antes de ser observadas.
Tinción de Gram
La tinción de Gram permite lo siguiente:
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Clasifica a las bacterias de acuerdo con si son capaces de retener el colorante cristal violeta (grampositivas se ven de color azul) o no (gramnegativas se ven rojas)
Destaca la morfología de las células (p. ej., se observa si son bacilos o cocos) y su ordenamiento (en grupos, cadenas, diploides).
Identifica los leucocitos polimorfonucleares, que indican una infección bacteriana en lugar de una colonización
Estas características pueden dirigir la elección de los antibióticos mientras se realiza su identificación definitiva. Encontrar una mezcla de microorganismos con múltiples morfologías y características de tinción con la técnica de Gram sugiere una muestra contaminada o una infección bacteriana polimicrobiana. El hallazgo de muchas células escamosas en una muestra de esputo sugiere que la muestra está contaminada con saliva y, por lo tanto, tiene una utilidad diagnóstica limitada.
Para realizar una tinción de Gram, los técnicos fijan el material de la muestra con calor a un portaobjetos, y lo tiñen mediante la exposición secuencial al colorante de Gram cristal violeta, yodo, decolorante y un contracolorante (por lo general, safranina).
Tinciones ácido-alcohol resistentes tradicionales y modificadas
Estas tinciones se utilizan para identificar los siguientes:
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Microorganismos ácido alcohol resistentes (especies de Mycobacterium)
Microorganismos moderadamente ácido alcohol resistentes (principalmente, especies de Nocardia)
Rhodococcus y géneros relacionados
Oocistos de algunos parásitos (p. ej., Cryptosporidium, microsporidia, Cystoisospora [Isospora] belli, Cyclospora, Balantidium coli)
Aunque la detección de micobacterias en el esputo requiere de al menos 10.000 microorganismos/mL, las micobacterias suelen estar en cantidades menores, por lo que su sensibilidad es limitada. En general, se usan varios mL de esputo que se descontaminan con hidróxido de sodio y se concentran por centrifugación para una tinción de este tipo. La especificidad mejora, aunque algunos microorganismos moderadamente acidorresistentes son difíciles de distinguir de las micobacterias.
Tinciones fluorescentes
Estas tinciones fluorescentes permiten la detección con menores concentraciones (< 1 × 104 células/mL). Algunos ejemplos son
Naranja de acridina (bacterias y hongos)
Auramina-rodamina y auramina O (micobacterias)
Calcoflúor blanco (hongos, especialmente dermatofitos)
En teoría, el acoplamiento de un colorante fluorescente con un anticuerpo dirigido contra el patógeno (inmunofluorescencia directa o indirecta) debe aumentar la sensibilidad y la especificidad. Sin embargo, estas pruebas son difíciles de leer e interpretar, y pocas se encuentran disponibles comercialmente y se usan con frecuencia (p. ej., las pruebas de anticuerpos fluorescentes directos para Pneumocystis y Legionella).
Preparados húmedos
Se pueden usar preparados húmedos de muestras sin teñir para detectar los siguientes elementos a través de microscopia de campo oscuro:
Parásitos (incluyendo huevos de helmintos y larvas)
Células clave vaginales (clue cells, presentes en la vaginosis bacteriana)
Organismos móviles (p. ej., Trichomonas)
Espiroquetas de Treponema (presentes en la sífilis)
La visualización de los hongos puede incrementarse aplicando una solución de hidróxido de potasio (KOH) al 10% para disolver los tejidos circundantes y los microorganismos no micóticos.
Tinción con tinta china (carbón coloidal)
La tinción con tinta china se usa principalmente para detectar Cryptococcus neoformans y otros hongos encapsulados en una suspensión de células (p. ej., en una suspensión de líquido cefalorraquídeo). Se tiñe el fondo del campo, en lugar del microorganismo en sí mismo, lo que hace que las cápsulas que rodean a los patógenos se vean como un halo. En el líquido cefalorraquídeo, la prueba no es tan sensible como la detección de antígenos del criptococo. La especificidad también es limitada; los leucocitos pueden parecer encapsulados.
Tinción de Warthin-Starry y tinción de Dieterle
Estas tinciones de plata se utilizan para visualizar bacterias tales como
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CDC/Sherif Zaki, M.D. Ph.D.; DVBD/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Bartonella henselae (la causa de la enfermedad por arañazo del gato)
Tinción de Wright y tinción de Giemsa
Estas tinciones se utilizan para detectar los siguientes:
By permission of the publisher. De Tefferi A, Li C. In Atlas of Clinical Hematology. Edited by JO Armitage. Philadelphia, Current Medicine, 2004.
Histoplasma capsulatum en los fagocitos y las células de los tejidos
Inclusiones intracelulares formadas por virus y Chlamydia
Trofozoítos de Pneumocystis jirovecii
Algunas bacterias intracelulares
Tinción tricrómica (tinción de Gomori-Wheatley) y tinción de hierro-hematoxilina
Estas tinciones se utilizan para detectar protozoos intestinales.
La tinción de Gomori-Wheatley se usa para detectar microsporidios. Puede ser incapaz de detectar la presencia de huevos de helmintos y no identifica al Cryptosporidium en forma fiable. Los hongos y las células humanas se tiñen.
La técnica con hierro y hematoxilina tiñe en forma diferencial células, inclusiones celulares y núcleos. Los huevos de helmintos pueden adquirir un color tan oscuro que no permita su identificación.
